Williams conquistou a primeira vitória contra uma adversária do top-50 em quatro anos na segunda-feira, quando a antiga número um mundial derrotou Camila Giorgi na estreia em Birmingham.
Mas a jogadora de 43 anos, sete vezes campeã de Grand Slams, não conseguiu somar duas vitórias consecutivas ao perder por 6-3, 5-7 e 6-3 para a letã Ostapenko na relva de Edgbaston.
Williams fez recuar brevemente os anos quando salvou um match point a 3-5 no segundo set, vencendo três parciais sucessivos quando Ostapenko, segunda cabeça de série do torneio, perdeu o ritmo.
Depois de Williams ter passado para a frente por 2-0 no set decisivo, parecia que a cinco vezes vencedora de Open de Wimbledon poderia estar a caminho dos quartos de final.
Mas Ostapenko, antiga semi-finalista de Wimbledon, recompôs-se e acabou por destruir as esperanças de Williams, que procurava uma sequência moralizadora em Birmingham antes do início do torneio de Wimbledon, em 03 de julho.
"Claro que podia arrumado a questão mais cedo. Fiquei um pouco desiludida depois do match point no segundo set. Mas a Venus é uma grande jogadora, uma grande campeã e é uma honra partilhar o court com ela", disse a antiga campeã do Open de França, Ostapenko.
"É uma jogadora muito perigosa, especialmente na relva. Estava a servir muito bem. Foi um pouco difícil, mas estou muito feliz por ter conseguido e por ter lutado até ao último ponto. Ela é um ídolo para muita gente, por isso foi muito especial", indicou.
Williams espera recuperar de uma lesão no joelho que a perseguiu em Birmingham, depois de lhe ter sido atribuído um wild card para Wimbledon, onde se estreou em 1997 e disputou a final mais recente de um Grand Slam em 2017.
Nos quartos de final, Ostapenko defronta a polaca Magdalena Frech, que venceu a oitava cabeça de série Sorana Cirstea, por 6-3, 6-7 e 6-4.
A britânica Harriet Dart vai defrontar a quarta cabeça de série Anastasia Potapova, que derrotou a americana Caty McNally, por 6-3, 2-6, 7-6(0).
Entretanto, vai haver um duelo totalmente checo entre a primeira cabeça de série Barbora Krejcikova e Linda Fruhvirtova, de 18 anos.
Fruhvirtova já tinha passado aos quartos de final e Krejcikova, ex-campeã do Open de França, juntou-se a ela ao derrotar Tereza Martincova, por 6-4 e 6-4.